摘要：骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区得到的单域抗体是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量为15kD，称为纳米抗体。纳米抗体具有容易表达、稳定性强、可溶性好等优点。这种小型抗体在基础研究、新药开发和疾病诊断与治疗上具有广阔的应用前景。本文主要针对纳米抗体的性质与应用进行阐述。
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　　关键词：重链抗体；纳米抗体；疾病诊断；疾病治疗
　　Properties and application of single domain antibody fragments
　　GU Kai1，ZHANG Juan1，ZHANG Cheng-hai2，WANG Min1
　　（1 China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，Jiangsu，China；2.Shanghai CP Guojian，Shanghai 201203，China）
　　Abstract：Heavy-chain antibody （HCAb） lacking light chain exists naturally in camel. The variable domain of HCAb， the smallest functional antigen-binding fragment is referred to nanobody， which molecular weight is 15kD. They are well expressed and have a high stability and solubility. As a new type antibody in basic research， drug development and disease diagnosis ， nanobody has a broad application prospects. This mini-review offers an overview of its properties and therapeutic.
　　Key words：Heavy-chain antibody ；Nanobody ；Diagnose ；Therapy
　　由于在疾病诊断与治疗方面的广泛应用，近20年来重组抗体技术得到迅速的发展。常规抗体是由两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链组成（图1a）。通过分子生物学的技术和手段，将抗体重链可变区和轻链可变区连接组成各种小分子抗体[1]如ScFv、Diabody（图1a），不仅保留了完整的抗原结合部位，而且具有较好的亲和力。但是，这些小分子抗体特别是多价形式的小分子抗体的表达很复杂。
　　骆驼体内存在的缺失轻链的抗体，只含有重链，因此又叫做重链抗体（图1b）。其N端结构域（VHH或者纳米抗体）能直接识别结合特异性抗原。VHH是可结合抗原的最小功能单位，其相对分子质量仅为传统抗体的1/10左右，大小为15kD，直径2.2nm，高度4.8nm，又被称作纳米抗体。目前，通过噬菌体，酵母和核糖体展示技术，从免疫，非免疫和半合成纳米抗体库[2-4]中筛选抗原特异性纳米抗体的方法已经建立。
　　图1 抗体的结构示意图
　　1纳米抗体的结构与性质
　　1.1纳米抗体的结构 纳米抗体只有一个结构域，没有Fc段，从而避免了Fc段引起的补体反应。与常规抗体的可变区相似，VHH包含4个框架区形成基本骨架，3个互补决定区是抗原结合的主要部位。与常规VH相比，VHH框架区序列的同源性高达80%[5]。
　　通过序列分析和结构解析，揭示了VHH具有一些独特的特征。VHH中位于FR2的4个氨基酸[6]（F37、E44、R45、G47）与VH中相同位置的氨基酸不一样。这几个在VH中是高度保守的疏水性氨基酸，而在VHH中是亲水性氨基酸，增加了VHH的水溶性。与常规抗体的VH相比，VHH的CDR1可变性更高，CDR3区更长，形成一个突出的环，较长的CDR3环与CDR1或FR2形成一个二硫键来稳定构象[7]。由于VHH只有一个结构域，比常规抗体小很多，所以在很多方面有广泛应用。
　　1.2热稳定性 1.3特异性 纳米抗体除了可以识别一些常规的表位外，由于其分子量很小，CDR3区较长，形成的环向外延伸，还可以识别常规抗体无法识别的抗原表位，例如酶的活性位点[10]和一些保守的凹陷的表位[11]。然而，一些半抗原和小分子多肽，通常结合在VH-VL的缝隙中，很难和VHH结合。
　　1.4组织渗透性 纳米抗体的分子量很小，很容易从肾小球滤过，导致VHH很快从血浆中清除，使VHH的半衰期很短。另外，VHH有很高的组织渗透作用，VHH很容易偶联一些毒素进入细胞内，Cortez-Retamozo等[12]利用纳米抗体偶联毒素物质作用于肿瘤细胞，其穿透性好，特异的作用于肿瘤细胞，不会引起其它组织损伤。
　　1.5表达性 VHH通常在原核系统中表达，氨基酸的差异对表达量有很大的影响。研究发现有几种形式的序列与表达量密切相关。①含有N端糖基化位点的序列，在酵母中的表达量显著提高[13]。②与常规VH相似的VHH，在酵母中的表达量会下降。③C端未形成二硫键的半胱氨酸会降低VHH表达量[14]。④VHH中一些位于FR2区域的一些亲水性氨基酸能够显著增加其在E.coli中的表达量。此外，一些多聚形式的的VHH表达量和单体的表达量相比明显下降[15]。
　　2纳米抗体的应用
　　目前，对纳米抗体的应用主要依靠其结构和功能特异性，由于其高的稳定性和亲和力使得其在许多方面具有广泛的应用。本文主要针对纳米抗体在疾病的诊断和治疗方面的应用进行说明。表1[16]显示了一些纳米抗体在相关疾病治疗方面的应用。
　　2.1构建多价和多特异性抗体 VHH分子量小，结构简单，易于操作，常用于构建多种不同形式的抗体。这些不同形式的抗体在诊断和治疗疾病方面具有许多常规抗体没有的优点：结合同一个抗原上的邻近的多个表位，从而提高对该抗原的亲和力；可以偶联毒性物质，如对细胞有毒药物、放射性物质等。 　　2.2作为细胞内抗体 抗体作用于细胞内的单位而起作用，对抗体的稳定性提出了更高的要求。由于细胞内是还原性环境，不利于二硫键的形成，所以需要二硫键稳定的常规抗体在在细胞内不能稳定存在而没有功能。纳米抗体的高稳定性，可溶性以及高表达性使其非常适合用作细胞内抗体。Gueorguieva等[17]利用噬菌体展示技术从驼源的纳米抗体库中筛选得到特异性结合介导细胞凋亡的蛋白Bax的抗体，此抗体能够在胞浆中稳定的存在，与Bax结合，抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，可用于神经退行性疾病的治疗。
　　2.3用作肿瘤的诊断和治疗 抗肿瘤研究存在两大难题：①早期诊断、②靶向治疗。此二者不仅要求药物在体内迅速到达疾病部位，而且要求对正常组织损伤降到最低。目前已有多种抗体药物可供治疗肿瘤。但是因为这些抗体属于大型蛋白质，难以穿透肿瘤细胞；并且他们的复杂结构使得大量生产非常困难且昂贵，因此在治疗癌症方面仍有改善空间。纳米抗体远小于常规抗体，且保有对肿瘤具专一性的特性；其稳定，分子量小，属水溶性蛋白质，使生产更容易且便宜。因此，在肿瘤的诊断与治疗方面比其他抗体更具优势。研究表明[18]一种与表皮生长因子竞争的纳米抗体，与表皮生长因子受体结合，以阻碍表皮生长因子与其特异性受体结合，从而阻断其信号通路，抑制肿瘤新生血管的形成。
　　2.4用于神经性疾病的治疗 药物透过血脑屏障准确到达疾病发生部位，是神经性疾病治疗面临的一大挑战。利用纳米抗体可有效的解决这一问题，将神经性药物连接到特异的纳米抗体，该抗体能将药物运输到大脑的特定部位，使药物发挥疗效。纳米抗体分子量小，稳定性高，组织渗透性强，耐高温、pH、盐等特性，使其在这方面的应用有很大的优越性。Muruganandam等[19]利用噬菌体展示技术成功筛选出两个特异性纳米抗体FC5和FC44，体外体内试验证明这两种抗体能有效透过血脑屏障到达靶部位，为纳米抗体应用于神经性疾病的治疗奠定了基础。
　　最后，纳米抗体作为一种新型抗体，具有完整的抗原结合能力。其分子量小、特异性强、组织渗透性高以及易于表达等优越性，使其在抗炎、抗感染及风湿性疾病等方面也具有很大的发展前景。
　　3结论
　　自1993年重链抗体发现以来，纳米抗体已经取得了快速的发展。在应用方面VHH具有很多常规抗体没有的优势。纳米抗体作为最小的具有完整功能的抗原结合片段，具备亲和力高、稳定性好、相对分子质量小、组织穿透力强、免疫原性低、易于操作等常规抗体所不具备的优越性，在疾病的治疗和诊断以及食品检验等领域等都有着广阔的应用空间[20]。然而，将纳米抗体应用于临床仍有许多问题需要解决，免疫原性是大分子药物用于临床治疗首要需要解决的问题，而且多价多特异性抗体及融合抗体分子量更大，多剂量重复使用将会产生更强的免疫原性，对治疗效果将会产生很大的影响。尽管如此，对于纳米抗体作为小分子治疗抗体的研究仍会不断持续，相信在不久的将来随着临床应用中各种问题的解决，纳米抗体在疾病的诊断和治疗中将发挥巨大功效。
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